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細胞培養板的選擇和使用問答-觀察

互聯網 2021-04-20 01:56:46

培養板的包被及相關問題:為了適應不同的實驗需要,可對培養板用不同的物質進行包被后使用,這其中有促進細胞黏附的,也有用于一些特殊檢測需要的。不同的實驗目的可能具體的方案亦不同,根據需要靈活掌握。

(一)多聚賴氨酸包被:

問:我要培養原代神經細胞培養,要用多聚賴氨酸鋪細胞培養板,請問賴氨酸液怎么配,怎樣鋪扳子

答:配制0.01%的多聚賴氨酸: 首先買來sigma 公司的多聚賴氨酸,如是25mg,就需要250ml三蒸水,用移液管將 少量三蒸水加到多聚賴氨酸的小塑料瓶中,然后將溶解的多聚賴氨酸加到200ml左右三蒸水中,(已置燒杯中)。最后加三蒸水達250ml,過濾除菌分裝與小瓶中即可。保存于-20度,近期用的話可放于4度冰箱內保存。 注意每一小瓶的量不要太滿,若20ml的瓶子,只裝15ml可,若太滿,放于-2度有可能會將瓶子弄碎,因凍后體積增加。(我就有這個教訓) 另外燒杯,小瓶、移液管都要滅菌處理的,泡酸高壓什么的。我們用的是一種用注射器過濾的過濾器,一次性的。一個能最多有效 過濾200ml。

鋪板的操作:首先要在消毒實驗室,包括超凈臺,紫外消度20-30分鐘。消毒后30分鐘進入實驗室。事先準備100ml三蒸水,經高壓滅菌處理。具體細節就不多說了。

首先打開板子,用消毒好的試管將0.01%的多聚賴氨酸加入每一孔中,大概每孔3-4滴吧。將板子蓋好放到培養箱中(37度 5%CO2)30分鐘。

取出板子,用吸管將多聚賴氨酸吸出。換吸管,加入三蒸水,沖洗三次,即將每孔內加入三蒸水,沒過底,多點也行。再將水吸出來。反復三次。注意換吸管,要無菌操作的。

最后將鋪好的板子放于培養箱待用。

如果你做免疫組化,需要放小的玻片到孔內,就在加多聚賴氨酸之前用無菌的鑷子將無菌的玻片夾到孔內即可。

問:PLL的分子量有3-5萬,7-15萬,15-30萬幾種,應怎樣選擇??謝謝:)

答:我們養神經細胞,用的是分子量3萬到7萬的pll 。

以PBS配成1mg/ml的母液,-20度保存。使用時,用高純度的蒸餾水稀釋成0.11mg/ml的使用濃度,過濾除菌,以50微升每平方厘米的量均勻涂于培養底物的表面,室溫下靜置5min,吸除多余液體,股風吹干即可。

問:多聚賴氨酸包被培養板后看上去應該是什么樣的??

要做原代培養,為了促進細胞貼壁,擬用PLL包被培養板。

1.我買的是博士德分裝Sigma的10ml的那種,可是院子里搜了一下,有人說沒有做過細胞培養試驗,不確定能否用于細胞培養!!這怎么辦,不能用么?

2.我的方法是這樣的,取了0。5ml,加入5毫升滅菌去離子水后,分成6份0.9ml,6孔板里放上玻片(準備以后做免疫組化直接取片子的),一個孔一份,室溫5分鐘后吸掉液體,超凈臺內吹干過夜。第二天D-Hank's液洗3遍,晾干,紫外線照一會兒再用。請問這樣做有沒有硬傷??

3.包被好后的板底及玻片應該是什么樣的呢??我發現板子干了以后,上面有些白點點,一開始以為是水滴,后來發現不是。莫非是PLL,那也是不是太夸張了??請問這種現象正常否??

PDL有用于組化玻片包被的不能用于細胞培養,你在用前需先確定是細胞培養級的,細胞培養板用PDL包被完后是看不出什么的,如果有顆粒是PDL在配制是未完全溶解,可看一下說明書。

我包被完用無菌水洗板子2-3次,吹干后很干凈,以前用PBS洗,吹干后也發現有白點,考慮是PBS中的鹽沉淀。

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(二)明膠包被:

問:在細胞原代培養時,在培養瓶里鋪明膠,國產的明膠也以可用嗎?它是用什么配置呢?還有怎么消毒明膠呢?請多指教,謝謝!

答:國產明膠不太好用,明膠可以用PBS溶液溶解,一般在100度煮15分鐘,趁熱分裝,分裝后放在4度,不要冰凍。

問:明膠消毒之后可以放置多長時間?還是現配現用呢?你說的分裝是指直接鋪在培養瓶嗎?如果不是的話,放在4度冰箱不是已經固定了嗎?固定之后有怎么鋪在培養瓶呢?因為是沒做過實驗所以很不明白。

答:sigma 有現成的終濃度是2%的明膠,已消毒,買來即可使用,方便而且不貴,僅100多塊錢。4度時明膠是膠凍狀,室溫下放置20-30分鐘就可變成液態,說明書上建議使用的包被密度是5-10ug/cm2。

國產明膠就可以的,用去離子水配成1%即可。可以一次配50ml或100ml。使用時取你所需量高壓滅菌即可。滅菌結束取出稍涼就可以鋪在培養瓶中。

問:明膠包板完畢后,培養皿要干燥呢還是保持濕潤?

答:明膠包被培養板或培養瓶24小時后, 將明膠倒掉,用培養基沖洗,就可以接種細胞了。

問:在園里搜索了一下關于明膠在細胞培養中的使用問題,還是有很多問題大家沒有詳細和標準的說明,現有幾個具體問題,請教各位戰友,

1.明膠溶液配置的問題:用無菌PBS配還是用去離子水配?我們實驗室有國產的明膠,很大一瓶的那種,能不能用于細胞培養?難道一定要用GIBCO 20ML即用型的?

2.明膠使用濃度的問題:有說0.1%,1%和2%的,我養的是內皮細胞,應該用哪種濃度呢?

3.明膠消毒的問題:有人說可以高溫高壓滅菌,有人說應該要過濾。。。還有人說要先高壓再乘熱過濾?不會吧,到底要怎樣?暈啊~~~

4.明膠包被培養瓶的問題:有人說包被后置培養箱過夜,用時在棄溶掉的,加PBS和培養液沖洗。。也有人說包被后吹干30min-60min 。再加培養液沖洗即可用,到底怎么個做法啊

5.明膠包被后的培養瓶使用期的問題:包被后的培養瓶能夠用多久呢?有文獻說包被7天,干2-3天后放4度保存可以在兩周內使用。

答:Q1.明膠溶液配置的問題

A1: 用去離子水來配即可。國產的行不行要去試驗,保險的就是買進口的。其實通常是買Sigma的gelatin粉末來配就好了,不用買配好現成的。配好的濃縮液可分裝放-20度長期保存,即將要用的濃縮液可放4度來備用。

Q2.明膠使用濃度的問題

A2:1%是濃縮母液的濃度,使用前才取適量稀釋成0.1%來包被。

Q3.明膠消毒的問題:

A3: Gelatin是用高溫高壓殺菌的, 其他你所說的方法也不是不能用, 只是沒必要。

Q4.明膠包被培養瓶的問題

A4:通常是包被1小時就夠了,然後吸乾,不需要清洗。因為你配gelatin溶液中並沒有含其他有害的物質, 沖洗只是多了一道沒必要的工作。包被完要清洗是Collagen才需要的。

Q5.明膠包被后的培養瓶使用期的問題

A5.這個我不知道,但基本上是越快使用越好。由於包被的過程很快,所以我都是當天包被, 在等的過程中可以去做其他的事,包被即將完成的前20分鐘就開始處理細胞,等細胞收下來包被也就做好了, 馬上就用。

0.1%的明膠適合大多數細胞培養時的包被,在四度放置不會出現凝膠狀。我參考的文獻說內皮細胞用1%的明膠包被,也就是母液,它在四度放置時會適度凝結。我的內皮細胞用1%的明膠包被效果我覺得還不錯。

不管你用包被1小時的方法還是包被4小時的方法,都最好從包被開始到使用的間隔不超過一天,包被的容器放置時間越長越不好。

(三)纖連蛋白((Fibronectin, FN)包被:

因為課題需要,我要養人外周血來源內皮細胞,得先用human fibronectin包被培養板。但是昨晚我看了個通宵,把論壇里關于FN包被培養板的帖子大致瀏覽了一遍,反而越看越糊涂了——幾乎就是百家爭鳴的局面:

從稀釋融解開始,有人說不能用三蒸水,要用制藥用的純水,否則PH值不對會影響活力;有人說用PBS,有人說用加了尿素的PBS;母液的濃度一般說是1mg/ml,但是買來的FN一般就是1mg,按這個濃度配置母液只能得到1ml,這么小的量如何分裝啊?

至于包被的濃度,差異更是很大,有人說各個公司的產品不一樣,還是以說明書上說的為準,是不是這樣啊?

另外,包被的方法,有4度過夜的,有37度過夜的,有37度2至3個小時的,還有四度過夜或37度2至3個小時的……

我買的是ROCHE的1mg裝human fibronectin,用的是corning的24孔板,最后對各種方案進行了摸索,結果見下面的帖子。

剛剛又再看了一下濃度的問題,大致歸結為以下三種方案:

1.論壇里大部分戰友用的還是50微克/毫升的濃度,室溫或37度下放置30至40分鐘。

2.我請教了有的人用的是10微克/毫升,4度過夜。

3.還有我見一篇文獻《成人外周血內皮祖細胞分離和誘導分化》中南大學學報(醫學版)J Cent South Univ (M ed Sci) 2005, 30 (5)上面寫的是1微克/毫升,37度過夜。

至此產生一個疑問:是不是這幾種方案都可行?濃度越高的,需要的溫度就越低,時間就越短,而最后達到的效果是一樣的?

如果真是這樣,那么以上3個方案是一個比一個便宜啊,那我干脆用第3方案得了?第1方案比第3方案貴了五十倍啊!比第2方案也貴了五倍。

非得花那么多錢嗎?FN不便宜啊!

各位戰友,我摸索了好幾次,總共試驗了以下方案:

1.50ug/ml,4度過夜;

2.10ug/ml,4度過夜;

3.50ug/ml,室溫下放置45分鐘至一小時;

4.10ug/ml,37度過夜;

5.1ug/ml,37度過夜。

現在養到了第四天,自我感覺貼壁效果最好的是方案4,而且該方案所用的FN還是方案2用過一次的,我把它回收了又重復利用,已經經過了一次凍融,按理說效果應該下降了不少了,但是它的貼壁時間早,細胞多而且形態比較接近長梭形,還聚集形成了很多集落樣的結構,如下圖:

至于溶解分裝,我是用滅菌注射用水1ml將其溶解為1mg/ml,然后分裝為八支EP管,負二十度保存。

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我要用人纖連蛋白包被培養板養細胞,請問自己如何包被,有無其他方法可替代?

以10μg/μl的纖連蛋白(Fibronectin)于4℃包被培養板過夜,接種細胞就可以了。

我用羅氏的Fibronectin 1mg/瓶,說明書推薦:配成50ug/ml,包被用量5ug/平方厘米。室溫下包被40分鐘,然后吸掉多余溶液,注意培養板不能干掉,包被后立即使用,可用PBS沖洗,但沒必要。具體濃度可根據實際需要調整(1~5ug/cm2)

(四)刀豆蛋白A包被:

問:我現在進行胰腺細胞培養,需要用刀豆蛋白A(Concanavalin A)包被細胞培養板。卻不知如何使用。想請教各位:Con A用什麼溶液溶解、多大濃度、包被需要多長時間。

答:包被液:Buffer A 碳酸鹽緩沖液(PH 9.5 0.05M),Na2CO3.10H2O 0.107g ,NaHCO3 0.073g ,二蒸H2O 25ml

包被液:10 ml+100ul2%NaN3+50ug抗原(5ug/ml)每孔100ul 。

(五)肝素化:

問:如何肝素化培養皿或細胞培養板,用于細胞與全血的共同培養 ?

答:用1250-2500 u/ml的肝素,濕潤培養皿或板,然后傾去既可。

(六)病毒包被:

問:我要做間接ELISA檢測抗體。要先把病毒包培養板,不知道怎么做!

答:我也沒做過, 但我覺得病毒事實上也是蛋白顆粒,,在物理性質上與普通蛋白無異,因此我覺得就是一個普通蛋白的包板而已。用碳酸鹽緩沖溶液。。4度過夜就行。。。,。。。

首先將病毒用包被緩沖液稀釋成最佳濃度包被,四度冰箱過夜。次日用洗滌液洗滌3 次。再將一抗加入其中。最后加入酶標抗體。

最重要的一點,為防止病毒的擴散傳播,一般事先都滅活才包被。

(七)anti-CD3單抗包被:

問:soluble anti-CD3單抗包被培養板時用PH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋,請問PH9.6的碳酸鹽緩沖液的配方是什么。另外IL-2在培養體系中用U/ml和 ng/ml,請問這如何換算。

答:包被液(pH9.6碳酸鹽緩沖液):精密稱取碳酸鈉 0.32g ,碳酸氫鈉 0.586g ,加水溶解,定容至200ml。

U/m是細胞因子的活性單位,細胞因子作用于特定的靶細胞,影響靶細胞的生物活性或細胞增殖動力學,通過檢測靶細胞的生物學活性或細胞增殖動力學變化,可間接反應細胞因子水平,所以生物學方法檢測結果表示為相對單位或生物活性單位,一般是通過與細胞因子標準品的所測結果進行對照得出生物活性單位。而 ng/ml是一個濃度單位,是通過免疫學檢測方法得到的一個定量結果,檢測的是細胞因子以及與細胞因子有交叉抗原的細胞因子前體等,常用ELISA法,如多克隆抗體和單克隆抗體,識別不同表位兩種單抗的雙抗體夾心法。由于結構和功能的不一致性,以及其它因素干擾,免疫學測定法和生物學測定法結果并不等同,所以兩種單位之間也是無法換算的。必要時,可同時進行檢測。

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